Значение метода полимеразной цепной реакции для диагностики инфекционных заболеваний

Суть ПЦР

С помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) стало возможным в лабораторных условиях, по сути дела в пробирке, повторить то, Значение метода полимеразной цепной реакции для диагностики инфекционных заболеванийчто происходит с молекулой ДНК в клетке – её самокопирование (репликацию). Этот процесс может повторяться много раз, столько — сколько понадобится экспериментатору, и идёт он с очень большой скоростью. С помощью метода ПЦР в исследуемых тканях любого организма можно найти любой маленький фрагмент ДНК или РНК. Участок нуклеиновой кислоты, состоящий всего из нескольких нуклеотидов, не только можно обнаружить среди большого числа других фрагментов, но и быстро размножить его, используя принцип комплементарности.

Этапы ПЦР:
— расплетение нитей двойной цепочки ДНК с участием фермента;
— расхождение нитей;
— достройка к каждой нити, недостающую цепочку по принципу комплементарности.

Процесс репликации, или удвоения ДНК, начинается на определённых участках, так называемых стартовых блоках.

Для того чтобы процесс пошёл, необходимы праймеры – короткие фрагменты нуклеиновой кислоты, являющиеся затравкой для синтеза недостающей комплементарной нити ДНК. Праймеры представляют собой искусственно созданные последовательности нуклеотидов. Они очень короткие, в их составе входит всего до 30 нуклеотидов. Чтобы создать нужные праймеры, надо знать точную последовательность нуклеотидов того фрагмента ДНК, который предстоит размножить. Ведь нуклеотиды праймеров должны быть комплементарны нуклеотидам участка ДНК.

Двухцепочечную ДНК сначала необходимо нагреть до стоградусной температуры. При этом нуклеиновая кислота денатурирует, её нити распрямляются и расходятся друг от друга. К этим нитям присоединяют, по принципу комплементарности, искусственные праймеры. «Стартовые» участки, состоящие из двух нитей, наконец созданы. Теперь начинает действовать Taq-полимераза – бактериальный фермент с высокой устойчивостью к повышенным температурам.

Этот термоустойчивый фермент синтезирует недостающие цепочки фрагментов ДНК на каждой цепочки, полученной в результате денатурации. Процесс осуществляется in vitro. Затем ещё один прогрев до 100 градусов. Синтезированные участки ДНК вступают в следующий цикл амплификации, но теперь они являются матрицами, и на них отливаются новые фрагменты ДНК, которые далее также примут участие в процессе в роли матриц. Такова полимеразная цепная реакция, относящаяся к реакциям матричного синтеза.

Схема ПЦР
Схема ПЦР

В итоге за три часа число копий изначального фрагмента ДНК не просто увеличится, это произойдёт в геометрической прогрессии. За двадцать пять циклов создаются 106 копий.
Они легко регистрируются визуально методами молекулярной биологии.

Матричный синтез ДНК методом полимеразной цепной реакции оказался революционным для генодиагностики. Знание последовательности нуклеотидов на исследуемом фрагменте дезоксирибонуклеиновой кислоты сыграло решающую роль при использовании этого метода.

Так как фермент ДНК-полимераза не может сама начать удвоение фрагмента ДНК, а только достраивает недостающую комплементарную цепь, то сначала происходит синтез двух праймеров. Они комплементарны последовательности нуклеотидов противоположных цепей ДНК. Праймеры примыкают к участку ДНК, выбранного для амплификации. ДНК-полимераза в направлении 5′-3′ синтезирует комплементарные цепи. Данные реакции специфичны и зависят от правильности синтезированных праймеров.

Температура в ходе процесса последовательно меняется: при 90-95 градусов выпрямляются и разделяются нити ДНК, при температуре до 60 градусов происходит присоединение праймера (так называемый отжиг), при 72 градусов идёт синтез цепей ДНК.

Термостойкий фермент ДНК-полимераза, благодаря своим свойствам не теряет активности и работает в течение всего процесса.

После 20-30 циклов, образуются огромное число копий исходного фрагмента ДНК, расположенного между праймерами. Метод ПЦР очень чувствителен и его можно использовать для анализа участков ДНК, например, из сперматозоида человека.

Метод ПЦР в медицине

Для метода ПЦР пригоден почти не обработанный биологический материал, он даже может быть разрушенным. Это позволяет исследовать пятна высохшей крови, разные смывы, взятые из ротовой полости, образцы срезов повреждённых тканей и многие другие материалы. Геномная ДНК и мРНК могут служить исходным материалом для полимеразной цепной реакции. Из мРНК получают кДНК , её и используют ПЦР. Это называется методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

ПЦР диагностика нашла своё применение для опознания герпеса, хламидиоза, гарднереллеза, микоплазмоза, уреаплазмоза и некоторых других инфекций.
Этот тонкий метод лабораторной диагностики позволяет выявить даже единичные клетки возбудителя заболеваний.

Метод уникален и его невозможно заменить в случае выявления латентных и хронических инфекций, ведь увеличивается число только ДНК бактерии, а не она сама. Таким образом, обнаруживаются бактерии и вирусы, вызывающие заболевания человека, которые невозможно идентифицировать в мазке или распознать методом ИФА. Например, очень часто при помощи ПЦР выполняют анализ ЗППП.

Основные особенности метода полимеразной цепной реакции:

— абсолютная специфичность (каждый возбудитель имеет уникальный фрагмент нуклеиновой кислоты);

— высокий уровень чувствительности (определяется множество копий в образце тканей);

— определяемость точного числа копий возбудителя, что играет важную роль в процессе лечения;

— одновременная диагностика сразу нескольких возбудителей разных болезней;

— возможность использовать для исследования любой материал;

— высокая скорость получения результата и автоматизация.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Обратите внимания, что, оставляя отзыв на материал и нажимая кнопку «отправить комментарий», вы соглашаетесь с Политикой конфиденциальности и Пользовательским соглашением данного сайта.